Plasterki żelu odpowiadające obszarowi od 72 do 194 par zasad, które obejmowały wszystkie zamplifikowane fragmenty CDRIII, zostały wycięte i potraktowane agarazą33. Według naszych danych, fragmenty CDR3 amplifikowane z normalnych limfocytów rozprowadzają od 79 do 151 par zasad (dane niepublikowane ). Odzyskany DNA ligowano do wektora faga M13mp1936 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) i transfekowano do szczepu E. coli DH5.F IQ (Bethesda Research Laboratories). Rekombinowane łysinki przeniesiono na podwójne filtry nitrocelulozowe. Jeden zestaw filtrów hybrydyzowano z sondami JC znakowanymi 32P w celu wykrycia wszystkich amplifikowanych sekwencji CDRIII, a identyczny zestaw hybrydyzowano z sondą CDRIII specyficzną dla białaczki pacjenta. Dla każdej próbki, procent białkowej sekwencji CDRIII obliczono jako liczbę płytek pozytywnych dla sondy swoistej dla białaczki podzieloną przez liczbę płytek dodatnich dla sond JC i pomnożono przez 100. Otrzymana wartość reprezentuje procent linii B ALL. komórki w populacji limfocytów B. Procent komórek białaczkowych w całkowitych komórkach szpiku oszacowano przez pomnożenie odsetka białaczkowych sekwencji CDRIII przez stosunek limfocytów obecnych w próbce szpiku, jak określono za pomocą analizy morfologicznej. W przypadku tej metody kwantyfikacji zakłada się, że wszystkie komórki limfoidalne w różnicach szpiku należą do linii B i mają tylko jedną rearanżację immunoglobuliny ciężkiego łańcucha. Dlatego też metoda prawdopodobnie zawyża nieco resztkową chorobę, ponieważ nie wszystkie komórki limfoidalne szpiku należą do linii B, a niektóre komórki B mają dwie rearanżacje. Wyniki
Tabela 2. Tabela 2. Data pobierania próbek szpiku kostnego i stan linii B u badanych pacjentów. Tabela podsumowuje dane kliniczne i laboratoryjne ośmiu pacjentów z ALL linii B w chwili rozpoznania. Pacjenci otrzymywali leczenie zgodnie z protokołami stratyfikowanymi ryzykiem u dzieci w grupie ALL.22, 23 Jak wskazano w Tabeli 2, próbki szpiku uzyskano w momencie rozpoznania i podczas lub po terapii; Pokazano również stan kliniczny pacjentów w momencie pobierania próbek. W okresie obserwacji (minimum 14 miesięcy, maksimum 51 miesięcy), sześciu pacjentów pozostawało w ciągłej remisji, podczas gdy pozostali dwaj pacjenci nawracali, albo w ośrodkowym układzie nerwowym (pacjent C135, 42,7 miesiąca po diagnozie) albo kość szpiku (pacjent C52, 8,6 miesięcy po rozpoznaniu).
Rycina 1. Rycina 1. Analiza Southern Blot przegrupowań locus ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. W porównaniu z kontrolą linii zarodkowej (pierwsze dwa pasma), jeden pacjent (C138) przeorganizował oba allele. Pozostali trzej pacjenci (C137, C135 i C52) mieli przegrupowanie tylko jednego allelu. E oznacza trawienie endonukleazą restrykcyjną EcoRI i H Hindlll. Groty strzałek wskazują zmienione allele. Ciężary cząsteczkowe (w kilobazach) podano dla pasm linii zarodkowej.
Figura 2. Figura 2. Sekwencje nukleotydowe CDRIII z klonów białaczkowych ośmiu pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną z linii B. Koniec 3 segmentów zmiennej (VH) (po lewej) i koniec 5 segmentów łączenia (JH) (po prawej) są wskazane
[hasła pokrewne: gastromed garwolin, globtrans, gastrolog garwolin ]
