Minimalna choroba resztkowa w białaczce limfoblastycznej typu B u dzieci – Trwałość komórek białaczkowych podczas pierwszych 18 miesięcy leczenia ad 5

Wykrywanie metodą Southern Blot specyficznych dla białaczki sekwencji CDRIII obecnych w szpiku wzmocnionym przez łańcuchową reakcję polimerazy od sześciu pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną linii B w remisji klinicznej. Status pacjenta i data próbkowania są wyświetlane nad każdym panelem. D oznacza diagnozę i remisję R. Southern bloty hybrydyzowano z sondami oligonukleotydowymi swoistymi dla każdego pacjenta (wskazane na Fig. 2). Drugi pas każdego panelu (puste) to kontrola negatywna (brak DNA), aby wykluczyć zanieczyszczenie. Trzecia ścieżka każdego panelu (limfa) jest kontrolą negatywną, aby wykluczyć krzyżową hybrydyzację, składającą się z mieszaniny zamplifikowanych sekwencji CDRIII z normalnych obwodowych limfocytów od sześciu zdrowych ochotników. Pozytywne sygnały obserwowane w próbkach remisyjnych od pacjentów C137, C138, C52 i C94 reprezentują resztkową chorobę.
Obecność minimalnej choroby resztkowej w próbkach szpiku pobranych od ośmiu pacjentów podczas remisji wstępnie określono przez powielenie próbek przez reakcję łańcuchową polimerazy CDRIII i hybrydyzację metodą Southern blot z sondami CDRIII każdego pacjenta specyficznymi dla białaczki. Wcześniej wykazaliśmy, że granica wykrywania sekwencji CDRIII metodą Southern blotting wynosi około komórki złośliwej na 10.000.21. Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne wyniki u sześciu pacjentów. U czterech z tych pacjentów (C137, C138, C52 i C94) oraz u Pacjenta C92 (dane nieukazane), sygnały hybrydyzacji wskazujące resztkową chorobę odnotowano w co najmniej jednej próbce z remisją podczas okresu kontrolnego. Warto zauważyć, że w próbce remisji uzyskanej od Pacjenta C52 na trzy miesiące przed klinicznym nawrotem w szpiku kostnym zaobserwowano dramatyczny wzrost intensywności sygnału hybrydyzacji (ryc. 4), pomimo normalnych wyników badań morfologicznych jego szpiku .
Figura 5. Figura 5. Ocena ilościowa resztkowej choroby podczas leczenia. Procent komórek białaczkowych we wszystkich komórkach linii B (liczby powyżej linii dla wszystkich próbek) lub w całkowitych komórkach zarodkowych szpiku (liczby poniżej linii dla próbek remisji) obliczono za pomocą oznaczenia ilościowego faga, jak opisano w Metodach. . W przypadku próbek diagnostycznych liczby poniżej linii reprezentują odsetek limfoblastów w szpiku, jak określono morfologicznie. UD oznacza niewykrywalny i centralny układ nerwowy OUN.
Aby ominąć problemy interpretacji i kwantyfikacji wątpliwych słabych sygnałów hybrydyzacji w analizach Southern, opracowaliśmy alternatywne podejście do szacowania minimalnej choroby resztkowej. Sekwencje CDRIII zamplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy z komórek szpiku B zebranych podczas remisji klonowano do faga M13 i transfekowano do E. coli. Uzyskane płytki fagowe przenoszono w dwóch powtórzeniach do filtrów. Jeden zestaw filtrów hybrydyzowano z sondą oligonukleotydową CDRIII specyficzną dla sekwencji białaczkowych, a identyczny zestaw hybrydyzowano z sondami konsensusowymi JH (JC), które rozpoznają każdą sekwencję CDRIII. Proporcja płytek dodatnich dla białaczkowej sekwencji CDRIII we wszystkich płytkach zawierających dowolną sekwencję CDRIII w przybliżeniu odpowiada ilości komórek białaczkowych B we wszystkich komórkach B szpiku w próbkach remisyjnych
[patrz też: trombocytoza, kopia odmiana, gastrolog garwolin ]