Minimalna choroba resztkowa w białaczce limfoblastycznej typu B u dzieci – Trwałość komórek białaczkowych podczas pierwszych 18 miesięcy leczenia ad

Krew obwodową uzyskano od zdrowych ochotników jako źródło normalnej populacji poliklonalnych komórek B. Jednojądrzaste komórki frakcjonowano na gradiencie Ficoll-Hypaąue (d = 1,077) 24; genomowy DNA wyizolowano z komórek jednojądrzastych za pomocą ustalonych procedur25 lub przez szybką lizę komórek z użyciem niejonowych detergentów. Ponowne uporządkowanie genu immunoglobuliny łańcucha ciężkiego analizowano metodą Southern blotting.25 DNA trawiono endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI lub Hindlll (Boehringer-Mannheim, Indianapolis). Bloty sondowano fragmentem 3,4 kb z regionu łączącego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (JH), 27, 28 znakowanego [.-32P] trifosforanem deoksycytydyny. [29]
Startery i sondy oligonukleotydowe i reakcja łańcuchowa polimerazy
Oligonukleotydy zsyntetyzowano metodami triestrowymi w fazie stałej. 30 Sens VH i antysensowne primery JH dla reakcji łańcuchowej polimerazy CDRIII zostały opisane wcześniej; primery zawierają miejsca klonowania SalI i PstI, aby umożliwić ligację zamplifikowanych sekwencji do rekombinowanych wektorów21. Sondy konsensusowe JH, które były stosowane do wykrywania wszystkich zamplifikowanych sekwencji CDRIII składały się z mieszaniny czterech 20-merowych oligonukleotydów pochodzących z sekwencji. genów J2, J3, J4 i J628 tylko 5 względem antysensownego startera JH. Sondy znakowano końcowo [.-32P] trifosforanem deoksyadenozyny metodą kinazy.
Reakcja łańcuchowa polimerazy została przeprowadzona w sposób opisany przez Saiki et al.8. Środki ostrożności przeciwko zanieczyszczeniu krzyżowemu zamplifikowanego materiału zostały pobrane zgodnie z zaleceniami Kwok i wsp.31 oraz przez osobne postępowanie z próbkami szpiku z okresów diagnostycznych i remisji. Porcję produktów reakcji łańcuchowej polimerazy zanalizowano za pomocą elektroforezy żelowej w 4% agarozie (NuSieve, FMC, Rockland, Me.) I metodą Southern blot z sondami oligonukleotydowymi specyficznymi dla białaczki, 21 z temperaturami prania ° C poniżej obliczonej temperatury topnienia sond. 32
Klonowanie i sekwencjonowanie sekwencji CDRIII z próbek szpiku diagnostycznego
Próbkę materiału zamplifikowanego przez reakcję łańcuchową polimerazy trawiono obydwoma endonukleazami restrykcyjnymi SalI i PstI (Boehringer-Mannheim), oczyszczono za pomocą elektroforezy żelowej i odzyskano z żelu przez traktowanie agarazą33 (Calbio-Chem, San Diego, CA). ). Odzyskany DNA ligowano do wektora skryptowego Blue (Stratagene, La Jolla, CA) i transfekowano do Escherichia coli (szczep JM 109) .34 Transformanty zawierające DNA CDRIII wykryto przez hybrydyzację z znakowanymi 32P próbnikami JC. Dwuniciową matrycę DNA z pozytywnych kolonii zsekwencjonowano metodą Sangera i wsp.35
Komputerową analizę danych z sekwencjonowania DNA przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji z Genetics Computer Group (Release 5, University of Wisconsin) i komputera Micro Vax II (Digital Equipment, Maynard, Mass.).
Kwantyfikacja resztkowych komórek białaczkowych
W celu dokładnego oznaczenia ilościowego udziału białaczkowych sekwencji CDRIII wśród wszystkich sekwencji CDRIII z komórek B obecnych w próbkach szpiku kostnego z okresu remisji zastosowano test ilościowego fagowania
[więcej w: gastrolog garwolin, ropomocz, trombocytoza ]